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科學前沿——新冠病毒致病新機制,這個病毒太全能!-北京博奧森生物技術有限公司
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科學前沿——新冠病毒致病新機制,這個病毒太全能!
發表者:北京博奧森生物      發表時間:2020-6-22

       據國家衛生健康委員會19日通報,6月18日0—24時,31個?。ㄗ灾螀^、直轄市)和新疆生產建設兵團報告新增確診病例32例,其中境外輸入病例4例(廣東3例,甘肅1例),本土病例28例(北京25例,河北2例,遼寧1例);無新增死亡病例;新增疑似病例2例,均為本土病例(均在北京)。


       SARS-CoV-2核衣殼蛋白(nCoVN)作為一種潛在的疫苗和治療靶點,在病毒基因組包裝和病毒自組裝中發揮著重要作用。2020年3月27日,廣東省Beating Origin再生醫學有限公司,中山大學,廣州醫科大學等多機構合作在MedRxiv在線發表題為“The Nucleocapsid Protein of SARS-CoV-2 Abolished Pluripotency in Human Induced Pluripotent Stem Cells”的研究論文,研究表明,nCoVN對iPSC的生理活性及多能性都有影響。



文章背景

      根據目前對SARS-CoV生命周期的認識,核衣殼蛋白由宿主細胞翻譯表達,主要定位于胞漿。核衣殼蛋白的主要功能是將病毒基因組包裝進核衣殼以保護基因組RNA。在核衣殼形成過程中,大量的核衣殼蛋白與病毒RNA結合并寡聚。病毒的繁殖策略是盡可能多地合成核衣殼蛋白,以滿足病毒組裝的需要,這就意味著核衣殼蛋白會生產過剩,而冗余的核衣殼蛋白會干擾宿主細胞的正常生理活動。

嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2(SARS-CoV-2)是COVID-19的病原體,與SARS-CoV的基因組同源性為79%。預測SARS-CoV-2共有12個編碼區,包括刺突蛋白、核衣殼蛋白、包膜蛋白和膜蛋白。越來越多的證據表明,SARS-CoV-2的刺突蛋白通過與人ACE2結合進入宿主細胞,表明SARS-CoV-2可能與SARS-CoV具有相似的致病機制。

ACE2在多種干細胞中表達

由于ACE2是細胞膜上SARS-CoV-2的主要受體,研究首先檢測了ACE2是否在干細胞中表達。圖1A顯示了不同項目的不同干細胞中ACE2的表達值,包括人類胚胎干細胞、iPSC、人類上皮干細胞、人類脂肪干細胞、人類造血干細胞和人類間充質干細胞。同時收集housekeeping基因GAPDH的表達值作為對照。ACE2在不同類型的干細胞中均有表達,但與GAPDH相比表達量相對較低。逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-RCR)結果顯示ACE2在iPSC、iPSC衍生心肌細胞(iPS -CM)和人冠狀動脈內皮細胞(HCAEC)中表達,提示這些細胞是SARS-CoV-2的潛在靶點(圖1B)。


nCoVN的過度表達促使iPSC向成纖維細胞分化

      為了研究nCoVN是否干擾iPSC的生理活性,該研究采用慢病毒表達系統建立了一種誘導性多能干細胞系(iPSC-nCoVN),在該系統中,nCoVN的cDNA序列轉錄依賴于Dox的誘導。經普羅霉素篩選后,iPSC-nCoVN分為兩組:一組用Dox誘導nCoVN表達(Dox+),另一組用DMSO作為對照組(DMSO+)。實時PCR檢測iPSC、Dox+和DMSO+組nCoVN的轉錄水平。在Dox+組中,nCoVN的表達增加了267倍(圖2A)。用細胞計數試劑-8比較iPSC組和Dox+組的增殖率。細胞接種3天后,iPSC的增殖率高于Dox+組,說明nCoVN可能阻礙iPSC的生長和分裂(圖2B)。繼續在iPSC中誘導nCoVN的表達,7天后,一些亞克隆的形態開始改變;誘導14天后,大多數細胞呈現出與野生型iPSC不同的形態;誘導28天后,出現典型的成纖維細胞樣形態(圖2C)。用抗成纖維細胞標志物α-SMA (Bioss, bsm-33187M, 鼠單抗)S100A4 (Bioss, bs-3759R, 兔多抗)的抗體來驗證這些成纖維細胞樣細胞的類型,免疫熒光分析結果證實Dox+細胞已轉變為成纖維細胞(圖2D)。

nCoVN的過表達抑制了iPSC的多能性

接下來,研究檢測了iPSC和iPSC-nCoVN中的多能性標記。多能性標記SSEA4和TRA-1-81在人胚胎干細胞和iPSC的細胞膜上表達,廣泛應用于多能性干細胞的鑒定。免疫熒光分析獲得的圖像清楚地說明,iPSC-nCoVN完全失去了SSEA4和TRA-1-81的表達,即iPSC-nCoVN在nCoVN存在的情況下失去了多能性(圖3)。

為了進一步檢測iPSC和iPSC-nCoVN的多能性,研究者又采用常規方法在相同條件下將這些細胞直接分化為心肌細胞。正如預期的那樣,iPSC的分化效率可以達到60%;然而,在分化第12天,只有很小的一部分細胞表達了心肌肌鈣蛋白T,同時伴隨著大多數細胞死亡(圖4)。這種分化實驗提供了確鑿的證據,證明nCoVN破壞了iPSC-nCoVN的多能性維持。

       這項研究指出,nCovN在人類誘導的多能干細胞中可以消除其多能性,降低增殖率,但不引起細胞凋亡。盡管采用了干細胞培養條件,nCovN的長期表達仍促使iPSC向成纖維細胞分化。據報道,SARS冠狀病毒核衣殼蛋白促進TGF-β誘導的PAI-1表達,促進肺纖維化,這也是nCovN將iPSC轉化為成纖維細胞的可能途徑。此外,nCovN如何打破iPSC的多能性維護仍是一個謎。干細胞的多能性維持需要精細的調控,以維持復雜網絡中多能性基因表達的平衡。由于nCovN具有結合RNAs的能力,nCovN可能通過占據RNAs的特定位點來抑制關鍵多能性基因的翻譯。盡管nCovN的作用機制尚不清楚,但其毒性作用提示SARS-CoV-2可能損害生殖系統和造血系統。

此文章來源于MedRxiv,侵刪?。?span style="font-size:15px;">

       面對如此狡猾又“全能”的病毒,當前甚至很長一段時間內,我們都將處于缺乏新冠特效藥,沒有百分百有效的預防措施和疫苗的階段。未來我們要做的是:勇于接受挑戰,客觀評估風險,科學調整管控級別,學會與新冠長期共存。在采取規范的預防措施的同時,恢復正常的生活秩序。


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